貼壁細胞的傳代培養實驗操作方法

實驗原理

細胞在培養瓶長成致密單層后，已基本飽和，為使干細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代(再培養)。傳代培養是一種將細胞種保存下去的方法，同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。

實驗材料

CO2培養箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、培養瓶、試管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75％秀精棉球、酒精燈、貼壁細胞株、*培養基(RPMLI640或DMEM)、0.25％胰蛋白酶、PBS液。

操作步驟

(1)傳代前準備

A.預熱培養用液：把已經配制好的培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

B.消毒：用75％酒精棉球擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

C.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

D.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

E.超凈工作臺內拆除已消毒空培養瓶的外包裝。

F.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后放入超凈工作臺內。

G.從培養箱內取出細胞：注意取出干細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在顯微鏡下觀察細胞。

H.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

(2)胰蛋白酶消化

A.入消化液：小心吸出舊培養液，用PBs清洗(沖洗)，加入適量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以蓋住細胞，*消化溫度是37℃。

B.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

C.終止消化：加入與消化液等體積的新鮮培養液。

(3)吹打分散細胞

A.打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

B.吸細胞懸液人離心管：將細胞懸液吸人10 mL離心管中。

C.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000r／min離心5 min。

D.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2mL培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

(4)分裝稀釋細胞

A.裝：將細胞懸液吸出分裝至2—3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。

B.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要時計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105個／mL。做好標記。

(5)繼續培養

用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放人CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2h后開始貼附在瓶壁上。

注意事項

A.嚴格的無菌操作。

B.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養干細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。